Geração de Gαi knock

Biologia da Comunicação volume 6, Número do artigo: 112 (2023) Cite este artigo

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Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são proteínas essenciais da membrana celular que detectam moléculas extracelulares e ativam respostas celulares. A família da subunidade α i (Gαi) da proteína G representa o parceiro de acoplamento GPCR mais comum e consiste em oito subunidades com propriedades de sinalização distintas. No entanto, analisar o padrão de acoplamento tem sido um desafio devido à expressão endógena das subunidades Gαi em praticamente todas as linhagens celulares. Aqui, geramos uma linha celular HEK293 sem todas as subunidades Gαi, o que permite a medição do acoplamento GPCR-Gαi após a reexpressão transitória de uma subunidade Gαi específica. Nós perfilamos a seletividade de acoplamento de Gαi em 11 GPCRs medindo a atividade inibitória induzida por ligante para acúmulo de cAMP. Os perfis de acoplamento são então classificados em três grupos, representando aqueles preferencialmente acoplados a Gαz, aqueles a Gαo e aqueles com seletividade inaparente. Esses resultados indicam que GPCRs individuais acoplados a Gαi ajustam a sinalização de Gαi exercendo preferência de acoplamento no nível da subunidade Gαi.

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs), os principais transdutores que ligam os estímulos extracelulares aos sinais intracelulares a jusante, são os alvos mais comuns para o desenvolvimento de medicamentos1. Após a ligação do ligante GPCR, as proteínas heteroméricas de ligação ao nucleotídeo guanina (proteínas G), consistindo nas subunidades α, β e γ, induzem a ativação de suas proteínas efetoras. Entre as três subunidades, a subunidade α determina principalmente as principais propriedades das proteínas G heterotriméricas individuais. O genoma humano codifica 16 subunidades α, que são agrupadas em quatro subfamílias com base em sua homologia de sequência e similaridade funcional, ou seja, Gαs, Gαi, Gαq e Gα122. A subfamília Gαi é o parceiro de acoplamento mais comum na família A GPCRs3,4. Além disso, aproximadamente 45% dos GPCRs visados ​​pelos medicamentos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos acoplam-se à subfamília Gαi5, destacando a importância dos GPCRs acoplados a Gαi como alvos de medicamentos.

Estudos anteriores mostraram que as subunidades Gαi têm funções distintas e sobrepostas. A subfamília Gαi consiste em oito subunidades α: Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαt1, Gαt2, Gαt3, Gαo e Gαz. A ativação do heterotrímero Gi induz vários processos de sinalização celular, como a inibição da adenilil ciclase e dos canais de cálcio e a ativação dos canais de potássio6. Apesar da alta homologia de sequência dentro da subfamília Gαi, várias funções específicas de subunidades foram relatadas. Por exemplo, a transducina (Gαt1 e Gαt2) e a gustducina (Gαt3) estão envolvidas na percepção visual e gustativa, respectivamente, ambas pela ativação da cGMP fosfodiesterase7,8. Além disso, usando experimentos knockdown da subunidade Gαi em células GH4C1, descobriu-se que Gαo e Gαi2 mediam a inibição da entrada de cálcio e acúmulo de cAMP, respectivamente9. As subunidades Gαi também se comportam bioquimicamente diferentes umas das outras. Deve-se notar, no entanto, que essas propriedades bioquímicas podem ser modificadas em células vivas, como observado em Gq, que mostra dissociação de nucleotídeos mais lenta na condição purificada do que na condição de membrana lipídica. Por exemplo, a taxa de dissociação espontânea do GDP de Gαo é uma ordem de grandeza mais rápida que a de Gαi1-310, e a atividade GTPase intrínseca de Gαz é 200 vezes mais lenta que a das outras subunidades de Gαi11. Essas diferenças entre os membros da família Gαi permitem diversas transduções de sinais GPCR acoplados a Gαi.

Embora as propriedades de sinalização das subunidades Gαi tenham sido bem caracterizadas, a seletividade de acoplamento da subunidade Gαi de GPCRs só foi investigada para um número limitado de receptores devido a dificuldades experimentais. O acoplamento GPCR-Gαi individual não pode ser avaliado simplesmente expressando uma subunidade Gαi de interesse porque praticamente todas as células de mamíferos expressam endogenamente múltiplas subunidades Gαi12. Para eliminar o acoplamento endógeno GPCR-Gαi, estudos anteriores usaram a toxina pertussis (PTX), que ADP-ribosila o resíduo de cisteína na cauda C-terminal das subunidades Gαi13. Ao expressar um mutante Gαi resistente a PTX com uma substituição no resíduo de cisteína, o tratamento com PTX permite a medição do acoplamento seletivo da subunidade Gαi mutante14,15,16. No entanto, alterar o resíduo de cisteína pode afetar as habilidades de acoplamento da proteína G das subunidades α17,18. Além disso, PTX não inibe Gαz, pois possui isoleucina no local de direcionamento de PTX19. Recentemente, técnicas baseadas em transferência de energia de ressonância de fluorescência ou bioluminescência foram usadas para avaliar o acoplamento de subunidades Gα individuais projetadas20,21. No entanto, esses métodos requerem a inserção de luciferase ou uma proteína fluorescente na subunidade α, e tal modificação afeta suas propriedades bioquímicas e a eficiência de acoplamento resultante22.